《自然》子刊：用于肿瘤检测中mirna生物标志物开发新方向|探针|扩增|特异性|pcr|mirna-欧洲杯足彩官网

microrna是内源性和短的非编码单链rna（18-23个核苷酸），参与信使rna的转录后抑制。由于mirna参与细胞增殖、分化和细胞死亡等各种生物学过程，因此失调的mirna与癌症等疾病的发病机制密切相关。在基于液体活检的癌症诊断、预后和监测中，探索循环mirnas是一种很有前景的策略。一个障碍是高性能检测生物样本中mirna的挑战，因为它们的长度短，在mirna家族中序列相似性高，在不同细胞类型和生物流体中的浓度范围大，以及相关的起源和载体的多样性。因此，迫切需要超灵敏、特异和稳健的生物测定和传感器，以促进临床上可行的疾病mirna生物标志物的开发。

逆转录定量聚合酶链式反应（rt-qpcr）已成为检测mirna的金标准工具。与长rna物种（如mrna）不同，短mirna需要特殊的rt过程来结合有助于pcr扩增和检测的扩展序列。已经开发了许多等温分析来推进mirna检测，包括滚环扩增（rca），指数扩增反应（expar），环介导的等温扩增（lamp），杂交链反应和催化发夹组装。尽管这些测定具有简单甚至无需仪器操作的优点，但也存在限制广泛临床应用的缺点，例如expar和lamp的非特异性扩增和高背景信号，以及杂交链反应和催化发夹组装的相对较慢的动力学和低灵敏度。其他标准技术，如微阵列、nanostring和测序，需要复杂的仪器或具有复杂的分析工作流程、高操作成本和有限的分析性能，这阻碍了它们在临床诊断中的广泛应用。

近日，一组来自美国的研究团队在杂志nature biomedical engineering上发表了一篇题为“a one-pot isothermal cas12-based assay for the sensitive detection of micrornas”的文章。在这篇文章中，研究团队报道了一种一步、一锅等温crispr-cas12a检测方法（extra-crispr），用于快速特异性检测mirna，其灵敏度与rt-pcr相当。作者将extra-crispr测定用于量化细胞外囊泡（ev）中的mirna生物标志物（mir-21、mir-196a、mir-451a和mir-1246），用于基于液体活检的胰腺导管腺癌（pdac）诊断，并通过对相同临床样本进行平行rt-qpcr分析，严格验证了extra-crspr测试的分析和诊断性能。结果表明，该技术可能有助于推进mirna检测和mirna生物标记物的临床开发，以用于基于液体生物检测的癌症诊断和预后。

图片来源：nature biomedical engineering

主要内容

extra-crispr测定的原理

extra-crispr检测被设计为三酶级联，利用crispr-cas12a系统的核酸剪切活性（顺式切割和反式切割功能），将线性rca转化为用于mirna检测的指数扩增方法。简言之，cas12a-rnp可以通过其顺式活性结合并切割rca的长ssdna扩增子，从而产生许多含有靶序列的二级引物来启动随后的rca循环，从而导致靶的指数扩增。同时，扩增子激活的cas12a rnp非特异性切割ssdna报告子以产生和放大荧光信号。

extra-crispr测定的原理和工作流程（图片来源：nature biomedical engineering）

extra-crispr测定法的优化和表征

作者优化了extra-crispr测定法的padlock探针结构、连接酶、变性退火步骤、rca相关缓冲液添加剂、聚合酶浓度、crispr组分如rnp和报告子浓度。优化后的extra-crispr测定法的分析性能通过金标准rt-qpcr的平行测量得到了系统验证。与商业mircury lna mirna pcr试剂盒相比，extra-crispr一锅法检测灵敏度相当，按照3小时实验流程其lod为1.57 fm。

为了评估此方法的特异性，作者检测了许多非靶mirna，包括一个在padlock-1连接位点具有单核苷酸错配的合成mir-21和8个1 pm的人mirna。这些测试产生的信号水平约为mir-21信号的2%，甚至更低（如下图k），显示了优异特异性。对于从连接位点偏移三个核苷酸的单个错配，仍然可以获得相当好的特异性，非特异性信号水平约为25%。总的来说，结果验证了一锅extra-crispr测定法，该测定法使用适当设计的padlock探针以个位数的飞摩尔敏感性和单碱基特异性快速检测mirna。

一锅法extra-crispr mir-21测定的优化（图片来源：nature biomedical engineering）

ev-mirnas定量分析ev衍生的mirna

作者采用了extra-crispr测定法来检测用于诊断pdac的小ev（sev）mirna，为此，使用细胞培养基和人血浆样品分离sev并提取短rna，然后使用一锅extra-crispr和两步rt-pcr测定进行平行测量在pdac中失调的mirna包括mir-21，mir-196a，mir-451a和mir-1246。通过extra-crispr检测三种mirna的校准图，从中确定mir-196a lod为1.35 fm（5–500 fm线性范围），mir-451a为4.14 fm（5–500 fm线性范围）和mir-1246为7.96 fm（20–500 fm线性范围）。这些lod与标准rt-qpcr测定的lod相当（下图c）。extra-crispr测定也显示出对四个mirna靶标的高度特异性检测，单个padlock探针和三个非靶标之间的交叉反应性最小（下图d）。总的来说，这些结果证实了extra-crispr方法有优异的敏感和特异性。

ev衍生的mirna的定量分析（图片来源：nature biomedical engineering）

ev-mirnas定量分析在胰腺癌症诊断中的应用

接下来评估了extra-crispr分析法，以测量无癌对照组（n = 15） 和pdac患者（n = 20） 的血浆样本。使用extra-crispr测量ev mirna，同时量化mir-21、mir-196a、mir-451a和mir-1246的水平。如图e所示，每个受试者的四种血浆ev mirna标记物的浓度，它们在pdac队列中的表达升高，与之前的研究一致。与单个标记物相比，ev sig（mir-21、mir-451a和mir-1246的加权线性组合）提高了区分pdac组和健康组的能力。auc值范围从mir-196a的0.677到mir-451a的0.793。ev-sig小组极大地提高了诊断能力，auc为0.853。

ev-mirnas定量分析在胰腺癌症诊断中的应用（图片来源：nature biomedical engineering）

用于poc测试的智能手机型extra-crispr分析

为了测试poc应用，作者试图建立一个低成本、便携式智能手机的extra-crispr检测系统。这个原型是由3d打印的身体部件、蓝色led管、光学滤波器和加热板组成（下图a）。将智能手机安装在设备上以获取荧光图像，然后对其进行分析以测量荧光强度。

作者首先评估了等温extra-crispr反应的poc原型，并与商业qpcr热循环仪进行了比较。结果显示，当检测从四名对照供体和四名pdac患者的血浆样本中分离的sev中的标志物，poc设备能够检测三种sev mirna标记物的差异水平，并区分pdac组与对照组，这与使用qpcr 等温测试的诊断结果一致。

评估用于低成本poc测试的extra-crispr测定（图片来源：nature biomedical engineering）

用于poc测试的extra-crispr-lfa分析

extra-crispr测试也可与侧流分析相结合（extra-crispr-lfa）。下图i显示了使用extra-crispr-lfa进行mirna检测的结果，其显示了随着靶浓度增加，测试线的强度增加。与荧光检测模式相比，lfa检测显示定量分析性能下降，表现为校准图的线性下降，100 fm lod和<2-log检测范围。尽管如此，extra-crispr-lfa测试在mirna检测方面大大优于现有的lod在皮摩尔水平的lfa方法。

使用相同的患者样本测试智能手机设备，结果证明了extra-crispr-lfa测试对sev mirna的无仪器临床分析的适用性。在这三种标记物中，sev mir-451a的lfa检测产生了最高的视觉信号（下图j）和最佳的诊断性能（下图k）来检测pdac样本。总的来说，对两种常用的poc检测模式的原理验证研究表明，extra-crispr技术有潜力成为开发新的低成本poc诊断测试的适应性工具。

用于poc测试的extra-crispr-lfa分析（图片来源：nature biomedical engineering）

总结与讨论

extra-crispr具有灵敏和特异的分析性能、易于操作、快速反应和低成本的特点，为临床样本中的mirna分析提供了一种替代标准rt-qpcr的有竞争力的选择。该方法的简单性将极大地促进未来仪器或微流体的小型化和集成，以完全自动化工作流程，进一步提高分析吞吐量和再现性，并减少样品消耗和周转时间。

extra-crispr检测与现有的基于crispr的生物传感方法有三个主要区别。首先，它同时利用了crispr–cas12a系统的顺式切割和反式切割活性的策略。其次，通过设计模块化padlock探针设计和反应动力学，将靶介导的连接、rca、cas12a结合和核酸切割的多种反应整合到一起，创建了一步单管等温分析。第三，这种一锅等温mirna检测提供了与标准rt-qpcr相当的分析性能，包括具有飞摩尔检测极限的高灵敏度、单核苷酸特异性和快速灵活的周转。最后，一锅extra-crispr技术极大地简化了分析工作流程，消除了对专用仪器的需求，为poc诊断提供了一种适应性强的模式。

本文转载自“小桔灯网”

责编|文竞择

校对|文竞择

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